适用对象：第一次接触 Western Blot（WB）、要检测细胞或组织中某个蛋白表达量的研究人员。
主线方案：哺乳动物细胞 / 普通动物组织总蛋白 → SDS-PAGE 电泳 → 湿法转膜 → 封闭 → 一抗二抗孵育 → HRP-ECL 化学发光显影 → 灰度分析。
文章说明：本篇以叙述为主、分步说明为辅。文中参数都是常规起始条件，实际操作请以本实验室 SOP、仪器说明书、抗体说明书为准；第一次上手，记得喊师兄师姐在旁边看着你。
一、写在前面的话：先别怕，WB 没有那么可怕
先说好，这篇教程我不想写成冷冰冰的 SOP，就想还原一下学长第一次带你做实验的样子：每一步先讲清楚"我们在干嘛、为啥要这么干"，再告诉你"手要怎么放、劲该怎么使"。WB 这个实验有个特点，流程拉得特别长，可每一步单独拎出来都不难。它更像做一桌菜，考验的不是某一道菜的刀工，而是整桌菜的节奏和细节。新手翻车，十有八九不是手笨，是不知道哪一步要紧、哪一步可以随缘。
先把整体节奏摆在你面前，你心里就有底啦。从提蛋白到出图，通常要横跨两天：
还有三句话，学长想在你动手之前就先塞给你。
失败真的很正常。我的第一条 WB 也糊得没法看，每个人的技术都是一张张"翻车膜"喂出来的，所以第一张跑不好，千万别往心里去。排查问题的时候，一次只改一个变量，不然你永远不知道是哪一步出的岔子。还有，实验记录本比你的记性靠谱得多，试剂批号、参数、当天的小异常，随手就写上，不然一周之后你一定想不起来。
好，深呼吸，咱们开始。
二、原理篇：搞懂原理，操作才不容易错
2.1 整个实验的一条主线
WB 想回答的问题其实特别朴素：我的样品里，某个目标蛋白有多少？不同组之间有没有差别？
可蛋白在细胞里混着几千个兄弟，看不见也摸不着。WB 的办法是先把它们按"个子高矮"（分子量）排好队，再复印到一张膜上，然后用一种只认目标蛋白的抗体去点名，点到了就发光。整条主线长这样：
图 2-1 WB 主线流程。灰色是起点，蓝色三个环节负责"把蛋白拿出来、分开"，绿色四个环节负责"把蛋白看见、变成数据"，箭头旁是需要特别留意的操作要点。
2.2 电泳为什么能把蛋白分开
SDS-PAGE 的核心是个很聪明的化学戏法。SDS 是一种去垢剂，它会把蛋白原本折叠的三维结构统统拉开，像给每个蛋白穿上同一件"泳衣"；更妙的是 SDS 本身带大量负电荷，均匀地糊在蛋白表面，等于给每个蛋白都绑上了跟它大小成正比的负电荷。这一来，蛋白进了电场，大家带的电荷比例一样、形状也一样，谁跑得快、谁跑得慢，就只剩分子大小这一个变量说话了。
凝胶本身像一张布满小孔的筛网。小蛋白身子灵活，钻得快，跑在前面；大蛋白被孔隙卡着，只能慢悠悠地走。跑完之后，几千种蛋白就按分子量从大到小排好了队，跟运动会上按个子高矮排队形是一个道理。
凝胶分两层。上面那层是浓缩胶，孔径大，不负责分离，只负责把上样的蛋白压扁成一条整齐的起跑线；下面那层分离胶，才是真正按分子量拉开差距的地方。至于还原剂（DTT 或 β-巯基乙醇），它负责打开蛋白内部的二硫键，让蛋白彻底舒展开，这就是上样缓冲液里必须加它的原因。
图 2-2 凝胶里发生了什么。同一份样品在浓缩胶里被压成一条整齐的起跑线，进入分离胶之后才按分子量拉开：大蛋白跑得慢、留在上面，小蛋白跑得快、跑到下面。
2.3 为什么要转膜
凝胶是一块"果冻"，又脆又容易变形，泡在液体里还可能让蛋白慢慢扩散。真拿它去做抗体孵育这种一折腾就是十几小时的活，实在不划算。所以我们用电场把蛋白从胶里横向搬到一张结实的膜上（PVDF 膜或硝酸纤维素 NC 膜）。膜就是凝胶的"复印件"，蛋白的相对位置保留下来了，膜却能剪、能折、能反复洗和孵育，好操作太多。
蛋白带着 SDS 给的负电荷，在电场里自然往正极跑。所以装配转膜装置时，凝胶必须靠负极（黑色），膜必须靠正极（红色），蛋白才能从胶里走出来贴到膜上。这是 WB 最经典的翻车点之一，一旦装反，蛋白就直接跑出胶掉进缓冲液里，膜上干干净净什么都没有。
2.4 为什么要封闭
膜吸附上蛋白之后，表面还留着一堆没被占住的"空座位"。抗体也是蛋白质，空座位不提前占满，一抗二抗就满膜乱坐，显影时整张膜灰蒙蒙一片。封闭就是先用无关蛋白（奶粉或者 BSA）把空座位统统坐满，之后抗体就只能老老实实去找目标蛋白结合啦。
2.5 一抗和二抗：侦探与提灯笼的传令兵
抗体识别是分两级的。一抗是"侦探"，它由免疫动物制备，能精准认出目标蛋白身上的某个特征（抗原表位）。可侦探自己不会发光，于是得请出二抗这个"传令兵"：二抗不认识目标蛋白，它只认一抗，准确说是认一抗来自哪个物种（兔、鼠、羊）。传令兵手里提着灯笼（HRP 酶标记），找到一抗就挂上去，一个一抗还能挂好几个二抗，信号就这样被放大了。
这也顺带解释了二抗的选择逻辑：看你一抗的宿主种属，不用管目标蛋白是什么。一抗是兔源的，就配抗兔二抗；鼠源一抗配抗鼠二抗。配错了，侦探和传令兵互相不认识，整张膜能安静得让你怀疑人生。
2.6 ECL 显影：灯笼集体点亮
ECL 是 HRP（辣根过氧化物酶）的化学发光底物。HRP 碰到底物就催化发光，膜上哪里挂了灯笼，哪里就亮，成像仪拍下来就是条带。条带越亮，通常代表目标蛋白越多。注意"通常"这两个字哦：只有在成像的线性范围内，亮度才和量成正比。过曝的条带已经饱和了，看着白花花一大条特别有成就感，实际上一丁点定量价值都没有。这个坑到结果分析那章还会细说。
2.7 WB 能回答什么、不能回答什么
最后需要说明一下。WB 很适合回答：目标蛋白在不在、各组相对表达量有没有变化、条带位置大不大致符合预期分子量、磷酸化水平有没有相对改变。但它不能单独证明：蛋白的确切定位（那是免疫荧光和免疫组化的活）、两个蛋白直接结合（那是 Co-IP 和 PPD 的活），也不能把条带强一倍直接等同于细胞里蛋白量精确多一倍。所以重要的结论，记得让 qPCR、功能实验、多个重复来互相撑着。零基础阶段就明白这个边界，以后写论文能少走好多弯路。
三、实验前的准备：把材料备齐
3.1 动手前先想清楚三件事
WB 翻车有一大类原因，说白了叫准备不足。开跑之前坐下来，确认三件事再动手。
你的目标蛋白到底长什么样？去 UniProt 或抗体说明书上查它的理论分子量，看看有没有糖基化、剪切体、前体形式。比如你要检测 BIP（HSPA5/GRP78），理论分子量约 78 kDa；EEF1A2 约 50 kDa。数字记在记录本上，后面选胶、看条带位置全靠它。
抗体的说明书你读过了吗？重点看五项：有没有做过 WB 验证（WB+）、推荐稀释比例、推荐封闭液（磷酸化抗体常常指定用 BSA）、阳性对照是什么、厂家示例条带在哪个位置。抗体说明书是整个实验里最值得逐字读完的一份文件，没有之一。
要不要做磷酸化？要的话，磷酸酶抑制剂从裂解第一步就得全程在场，封闭液也得换成 BSA，具体原因到封闭那章再细讲。
3.2 试剂清单
下面这张表按实验流程的顺序，把常规 WB 的试剂都列出来了。建议打印出来，对着冰箱和试剂柜一项项打钩，别跑到一半才发现缺材料。
这几样里，抑制剂和 Marker 最容易被人忘掉，而它们恰恰缺一不可，备料的时候多看一眼。
3.3 器材与耗材清单
仪器方面，你会用到这些大件：微量移液器（20/200/1000 µL 三把枪练熟是基本功）、4°C 冷冻离心机、金属浴或水浴锅、垂直电泳槽加电泳仪电源、湿转槽（或者半干转仪）、水平摇床、酶标仪、化学发光成像仪。第一次用任何一台仪器，都先请人演示一遍再自己上手，尤其是电泳电源，接线方向反了整块胶就白跑喽。
耗材方面：1.5 mL 离心管（建议低吸附款）、滤芯枪头、细胞刮刀、PVDF 膜（常规 0.45 µm，目标蛋白小于 20 kDa 时换 0.22 µm）、厚滤纸、转膜海绵垫、平底镊子（别拿尖头去戳膜）、铅笔（给膜做标记，记号笔不行）、孵育盒、封口膜、冰盒和碎冰，再加上实验服、手套和废液分类的容器。
还有一句掏心窝的话：新手千万别自己灌胶。未聚合的丙烯酰胺是神经毒素，配胶还要用到 APS、TEMED 和相当精确的手法，学习成本高，安全风险也不小。市售预制胶又便宜又稳定，先把整条流程跑通，灌胶这门手艺以后有的是机会学。
3.4 安全这几条，别嫌学长啰嗦
WB 里的危险分子比想象中多。甲醇易燃有毒，β-巯基乙醇气味刺鼻、毒性也不小，丙烯酰胺（如果你以后自己配胶）是累积性神经毒素，ECL 里某些组分也有刺激性。所以称量配液去通风橱做，手套湿了马上换，废液按有机相、含染料液、普通水相分开倒，电泳电源通电前确认手是干的，先关电源再开盖。这些习惯从第一次就养成，以后会救你自己好多次。
四、样品制备：把蛋白完好无损地"请"出来
4.1 为什么全程要低温、要加抑制剂
细胞是一袋活着的平衡系统。裂解的那一刻膜一破，原本被区室隔开的蛋白酶、磷酸酶全放了出来，开始疯狂啃食你的蛋白：蛋白酶把蛋白剪碎，磷酸酶把磷酸基团一个个薅掉。你要做的，就是让这场"自助破坏"慢下来。低温让酶变慢，抑制剂直接让酶住手，两件事缺一不可，可别以为放冰上就万事大吉了。
所以从这一步开始，你会发现自己不停地在冰盒、离心机和冰箱之间来回奔波。嗯，WB 前半段就是这样，全套动作都是围着"蛋白别坏掉"这一件事转的，多跑几趟就习惯了。
4.2 贴壁细胞：从培养皿到上清
先把东西备齐：RIPA 裂解液里现用现加好蛋白酶抑制剂（做磷酸化就再加磷酸酶抑制剂和 PMSF），PBS、离心管、刮刀全部预冷，离心机也提前降到 4°C。然后按下面的节奏走：
吸走培养基，用预冷 PBS 轻柔洗细胞 1–2 次，下手轻一点，别把细胞层冲掉了；
尽量吸干残留 PBS，残留会稀释裂解液；
按比例加入预冷裂解液。六孔板一个孔 100–200 µL，10 cm 皿 0.5–1 mL，能盖住细胞层就行，不用贪多；
冰上静置裂解 15–30 分钟，中间每隔几分钟倾斜晃一晃，让裂解液均匀接触到细胞；
用细胞刮刀把细胞刮下来，连同裂解液一起转到预冷离心管里；
4°C、12 000–14 000 ×g 离心 10–15 分钟；
小心取出离心管，别搅动底部的沉淀，把清亮的上清转到新管，这就是你的总蛋白啦。
要是样品特别黏稠、能拉丝，那是 DNA 在捣乱，喊师兄师姐教你在低温下做短时超声，别硬着头皮直接上样。
图 4-1 离心管里的三层。总蛋白在中间那层清亮的上清里，吸头停在沉淀上方，别碰底下的沉淀，也别把表面的油脂吸进来。
4.3 组织样品
组织的逻辑一样，只是"开门"更费劲一点。取材后尽快处理，或者液氮速冻保存。操作时在冰上把组织剪成小块，按大约 10 µL 裂解液对应 1 mg 湿组织的比例加含抑制剂的预冷裂解液，然后匀浆（电动匀浆器或者研磨都行）。这里要留神，匀浆是发热大户，打几下、停一停、插回冰里，别一口气把样品打成温热的"蛋白汤"。后面的裂解、离心、取上清跟细胞样品一样。取上清的时候注意两点：别吸到底部沉淀，也别把最上层那层油脂吸进来，脂肪组织样品尤其常见。
4.4 BCA 定量：让每个泳道公平起跑
这一步很多新手想跳过，心里想的是"反正都是一样多的细胞，浓度应该差不多吧"。真的不行哦。不同组的提取效率、剩余体积都会有差异，上样量不齐，后面的条带差异就说不清是处理效应还是你手抖了。上样量一致才是比较的前提，这就是定量的意义。
BCA 的原理一句话能说清：蛋白在碱性条件下把 Cu²⁺ 还原成 Cu⁺，Cu⁺ 和 BCA 显色剂反应会变紫，颜色越深蛋白越多，用酶标仪在 562 nm 附近读数，对着 BSA 标准曲线就能算出浓度。操作跟着试剂盒说明书走，几个要点记牢：标准品按说明配成浓度梯度；样品浓度未知时先做 2–3 个稀释度预试，免得读数飞出标准曲线；标准品和样品最好都做复孔；孵育温度和时间严格按说明书来，别凭感觉。
拿到浓度后算上样体积，公式很简单：
取样体积（µL） = 每孔上样量（µg） ÷ 样品浓度（µg/µL）
示例：浓度 2.0 µg/µL，每孔上 20 µg → 取 10 µL 样品
4.5 配样与变性：最后一道预处理
现在把每个样品调成"上样状态"。以每孔 20 µg、总体积 20 µL、5× 上样缓冲液为例：
混匀、短暂离心把液体甩回管底，然后 95–100°C 加热 5 分钟变性。加热完立刻插回冰上，再快速离心 30 秒，把蒸发到管盖的水珠甩下来，免得开盖时溅洒、或者浓度悄悄变了。马上要上样的样品放 4°C 短暂等着；不马上用的分装后放 -20°C 或 -80°C，千万别反复冻融。
另外提一句进阶的：多次跨膜的膜蛋白在 95°C 下反而容易聚集抱团，条带会消失或者跑得乱七八糟，这类蛋白常用 70°C 加热 10 分钟代替。是常规蛋白就放心 95°C，拿不准就翻抗体说明书，或者直接问带你的师兄师姐。
五、电泳：让蛋白按分子大小排队
5.1 选胶：先看目标蛋白的分子
凝胶浓度决定孔径大小，孔径又决定能分开多大范围的分子量。选胶看下面这张速查表就够了：
规律很好记：蛋白越小，用越浓的胶，孔小才拦得住它。举个例子，如果你想同时检测 BIP（约 78 kDa）和 EEF1A2（约 50 kDa），一块 10% 的分离胶就能把两个都照顾得很好，省事又省钱。
图 5-1 分子量全景尺。左侧按分子量区间给出推荐的分离胶浓度，右侧把常见目标蛋白和三个常规内参放在同一把尺上；内参能不能用，要看它跟目标蛋白的条带位置分不分得开。
5.2 装胶与检漏
取出预制胶，核对浓度、孔数和有效期，撕掉底部封条。拔梳子这一步要垂直、缓慢地拔，斜着拔或者猛地一拽，加样孔就歪了、裂了。装进电泳槽后先别急着加满：往内槽倒电泳液，盯着液面看 30 秒，液面在降就是漏液，重新装一遍。不漏了再补满内槽，按说明书加够外槽。最后用电泳液把每个加样孔冲一冲，把残留的保存液和碎胶冲掉，上样时样品才不会漂起来。
5.3 上样：新手最容易心跳加速的三分钟
上样是整个 WB 里最考验手稳的一步。第一次手抖太正常啦，学长当年经常把样品戳进胶里、漂得到处都是。分享几个能立刻提升成功率的要点：
把泳道图放在手边，样品按图排队，每管上样前先涡旋混匀、短暂离心；
用细长的上样枪头，枪头伸到孔口液面之下一点点就好，太深会戳破胶底；
稳住手：手肘撑在桌面上，两只手都搭在枪上，眼睛和加样孔保持平视；
缓慢、匀速地推。看到样品因为比重大沉到孔底，蓝色一整条稳稳待在孔里就对了；推快了样品会喷出来漂走；
每换一个样品换一个枪头，第一孔留给 Marker；
上样量从每孔 10–30 µg 总蛋白试起，新手用 20 µg 就行，别贪多，上太满条带会拖尾变形。
图 5-2 上样时的枪尖位置。左边是正确做法，枪尖停在液面下一点点；右边三种是新手最常见的错误，对应的后果写在每格下面。
上坏了怎么办？只是个别孔漂了，就用移液器把漂走的样品小心吸回来重上；孔破了就别勉强，这块胶该换就换，带伤的胶跑完只会更难看。
5.4 跑胶：电压、时间与终点判断
盖好槽盖，确认红黑电极没插反，通电。常规节奏是：浓缩胶阶段 80 V 左右跑 20–30 分钟，看到蓝色染料前沿压成一条整整齐齐的细线、进入分离胶之后，调到 120 V 左右继续跑。当溴酚蓝前沿跑到距胶底约 0.5 cm 时停，全程大约 1–1.5 小时。中间可以来看几次：条带均匀往下走、前沿平直、槽里有细密的小气泡、电流稳定，就都是好迹象。要是发现条带"微笑"着两头翘，或者槽体烫手，那是电压太高或者散热不好，后面转膜前记得调低哦。
停机记住这个口诀：先关电源，再开盖。这是电气安全和样品安全的双重保险。
六、转膜：把蛋白"复印"到膜上
6.1 转膜前的准备
跑胶快结束时就可以准备转膜的东西了，转膜液提前 4°C 预冷。按凝胶大小裁好 PVDF 膜和 6 张滤纸（每侧 3 张）。膜上的标记一定用铅笔在角上写编号，记号笔的墨水会溶于甲醇，还会增加背景，千万别用。
然后是 PVDF 膜的"激活仪式"：把膜浸进甲醇里 30 秒到 1 分钟，你会看到它从乳白变成半透明，这就是激活成功。随后依次转入纯水、转膜液各平衡几分钟。记住，膜从激活那一刻起就不能再干了，干过的膜会产生花斑背景，基本宣告这张膜报废。NC 膜不用甲醇，直接在转膜液里润湿就行。滤纸和海绵也在转膜液里一起泡着。
6.2 组装"三明治"：方向错了全盘皆输
打开转膜夹，按从黑（负极）到红（正极）的顺序铺层，全程在转膜液液面下操作：
图 6-1 转膜三明治的层序与方向。从上到下就是铺层顺序，蛋白在电场里从凝胶走向膜，所以永远是胶靠黑、膜靠红。
口诀就一句：胶靠黑、膜靠红。蛋白带负电往正极跑，才能从胶里走出来贴到膜上。铺的时候每层都对齐，尤其凝胶和膜这一对，位置差一点条带就错位了。
铺完用滚轮（洗净的玻璃棒、15 mL 离心管也行）从中间向两边轻轻滚压，把层与层之间的气泡赶出去。气泡是绝缘体，它待在哪，哪块区域的蛋白就转不过去，显影时就是一个尴尬的空白圆斑。滚完再检查一遍四角，确认没藏气泡，把夹子锁好，按方向插进转膜槽，倒入预冷转膜液，放上冷却模块，或者干脆把整个槽坐在冰水混合物里。转膜是大电流过程，发热特别凶，不降温轻则条带变形，重则蛋白降解。
6.3 转膜参数
常规小型胶湿转的起始条件是 100 V、60–90 分钟、低温。不过转膜时间要跟分子量商量着来：
转完先关电源，再拆装置。这时候你可以立刻验收：预染 Marker 应该已经印在膜上了。再配合下一步的丽春红染色，转膜质量一目了然。
6.4 丽春红染色：给转膜结果拍张"证件照"
丽春红 S 是一种可逆的总蛋白染料。染上几分钟，每条泳道的总蛋白分布一览无余；水一洗还会褪掉，完全不影响后续孵抗体。操作很轻快：膜浸入丽春红染液轻摇 5–10 分钟，条带显现后用纯水洗到背景变浅，立刻拍照存档（这张照片以后就是审稿人问起上样一致性时的救命证据），然后接着水洗至完全褪色，再进封闭。
理想的照片是什么样？各泳道总蛋白量肉眼看着差不多，Marker 清晰，没有大片空白、折痕和白斑。要是某一泳道明显偏淡，先别急着怪抗体，多半是那孔蛋白没提够、或者没转过去，带着这个疑问往下走，后面分析的时候心里有数。
图 6-2 丽春红照片的四种样子。最左边是合格的样子，另外三种分别指向蛋白没提够、夹层里有气泡和膜干过，正好对应第十二章里的几条。
七、封闭：先把"空座位"占满
转膜检查合格后，把膜转进干净的孵育盒，蛋白面朝上，倒入 5% 脱脂奶粉 TBST 溶液（20 mL TBST 加 1 g 奶粉，充分搅拌到看不见颗粒，没化开的奶粉疙瘩后面会变成膜上的白点），室温轻摇 1 小时。液量要足，让膜能自由漂动、完全浸没，膜贴壁或者露一角都会造成局部背景异常。
封闭液不是"无脑选奶粉"哦，这里有一道经典判断题：
一句话记住：做磷酸化，封闭和抗体稀释都用 BSA。封闭结束可以直接进一抗，通常不用洗（抗体说明书另有要求的除外）。
八、一抗孵育：让"侦探"去找目标
8.1 稀释计算：别把比例算反
按抗体说明书推荐的稀释比配工作液。以推荐 1:1000、需要 10 mL 为例：
一抗体积 = 10 000 µL ÷ 1000 = 10 µL
稀释液体积 ≈ 9990 µL（用抗体稀释液或 5% BSA/TBST）
注意"1:1000"的意思是 1 份抗体加到终体积 1000 份里，不是加 1000 µL 稀释液。还有个特别实用的细节：如果你只需要 5 µL 抗体，算出来却要吸 0.5 µL，别硬用 2.5 µL 量程的枪去吸，误差会大得离谱。正确做法是把总体积做大一点，或者先做一次 1:10 的中间稀释。
8.2 孵育操作
把膜从封闭盒转入盛有一抗工作液的盒子（也可以拿封口膜做个"液滴孵育台"省抗体），确保膜完全浸没、不折叠、不贴壁。常规方案是 4°C 冰箱里、摇床缓速轻摇过夜，12–16 小时。慢摇就一个目的：让膜表面均匀接触抗体。静置不动的话，膜底下那面压根接触不到抗体，出来就是阴阳脸。
孵育记得记下开始时间、温度、稀释度。听起来啰嗦，可下次想复现或者排查的时候，这些数字就是全部的线索。
8.3 关于抗体回收
一抗不便宜，多数实验室会把用过的稀释一抗回收，4°C 保存，标注抗体名、稀释度、日期和已用次数，下次接着用，效果通常没问题。不过有两条得守住：一是回收液别反复冻融、别放太久，一般两三周内用完，具体看抗体性质和实验室习惯；二是关键的定量实验别用快过期的回收抗体，效价一降，组间比较就悄悄失真了。
九、洗膜与二抗孵育：把信号放大
9.1 洗膜：重要但最容易被敷衍的一步
一抗孵完，膜上还挂着一堆没结合或者乱结合的抗体，得用 TBST 冲走。方法朴实无华：倒掉一抗（或回收），加足量 TBST，室温摇床洗 3 次、每次 5–10 分钟，而且每次都要换新鲜 TBST。拿同一盆洗液晃三遍可不算洗了三遍，被洗下来的抗体还留在盆里呢。
洗膜的本质是"洗掉噪声、留住信号"。洗不干净，后面背景高得像毛玻璃；但洗上一小时也没必要，温和的 TBST 常规流程足够。另外，膜在盒里要能自由滑动，液量太少、膜贴壁、摇床忘开，都等于白洗。
9.2 二抗怎么选：看一抗的"国籍"
原理篇讲过，二抗认的是一抗的宿主种属。对照下表选就行，拿不准就把自己一抗的货号页面打开，厂家一般会直接告诉你配什么二抗：
还有个容易踩的坑：如果你的两条一抗来自同一物种（比如都是兔源），又想同膜孵两个抗体，那就必须靠裁膜把两条带分开，或者用荧光多色系统。这个进阶玩法第一次做 WB 用不上，知道有这回事就好。
9.3 二抗孵育与二次洗膜
二抗按说明稀释（常见 1:5 000 起步，品牌差异挺大），室温轻摇 1 小时。二抗这东西贵不了几个钱，但特别"猛"，一定要宁稀勿浓，过浓是高背景和满膜杂带的第一大常见原因。
二抗之后还有一场更重要的洗膜：TBST 洗 3–4 次、每次 10 分钟。ECL 灵敏度极高，残留的二抗会被无限放大成一片惨白。做磷酸化实验的话，最后一步可以换成不含 Tween 的 TBS 再过一遍，有人觉得条带观感会更好，属可选项。洗完的膜不要干放着，马上送去显影。
十、ECL 显影：让条带亮起来
10.1 配液与孵育
先把成像仪打开，调到化学发光模式预热，顺便把托盘擦干净。托盘上一次实验残留的 ECL 液滴，会变成让你百思不解的"假亮点"。
ECL 工作液就是 A 液和 B 液按 1:1 现配现混（普通 ECL 每张 mini 膜 1–2 mL 足够）。吸头碰过 A 就别再去碰 B 的瓶口，交叉污染会让整瓶试剂提前失效。把膜从洗液里取出，在吸水纸上轻轻沥一下（别吸到半干，膜得保持湿润），蛋白面朝上放进洁净的保鲜膜或者成像托盘，均匀铺上 ECL 工作液，静置 1–3 分钟。然后盖上透明保鲜膜，把气泡和多余的液滴赶掉，气泡挡住的地方不发光，又是一个白斑。
10.2 曝光策略：宁可多拍，不可过曝
把膜送进成像仪，先跑一次自动曝光看看有没有信号，然后手动多档曝光：比如 10 秒、30 秒、1 分钟、3 分钟各拍一张，全部保存下来。这么做的道理很实际：短曝光保住细节（强条带不过曝），长曝光保住弱信号（低表达组也看得见），最后定量时挑那张"目标条带和内参都没饱和"的图用就行。
图 10-1 四档曝光与信号饱和。短曝光保住细节，长曝光保住弱信号；只有落在绿色线性范围内的那几张可以用于定量，已经饱和的图再亮也不能用。
怎么判断过曝？三个特征：条带内部一片死白（反相后是死黑），完全没有灰度过渡；软件提示像素饱和；条带边缘膨胀，相邻条带粘在一起。过曝的条带就像烧焦的照片，看着信号最强，其实信息量为零。如果各档曝光都过曝了，说明信号本身就太强，下次降低上样量或者稀释一抗，别硬拿这张图去凑数。
10.3 曝光之后
拍完第一时间做三件事：把原始图像导出保存（优先 TIFF 等无损格式，文件名带上日期、目标蛋白、膜编号和曝光时间）；趁膜还在手边，用铅笔在角上做标记，跟泳道图核对一遍；把膜封进保鲜膜放 4°C，以备需要重新显影或者加拍。原始整膜图、多档曝光、丽春红照片，三样凑齐，你的数据才算有了"出生证明"。
十一、结果分析：从一条条带到一张柱状图
11.1 先当一回质检员
拿到条带图，先别急着测灰度。花五分钟当一回质检员，逐条问自己：条带位置和预期分子量对得上吗（差一点点没关系，糖基化、剪切都会让表观分子量偏移，差很远就得警惕了）？阳性对照出带了吗？Marker 位置正常吗？目标条带附近有没有一堆解释不了的杂带？这张图饱和了吗？各泳道内参的强弱是不是肉眼可见地均匀？任何一项不过关，都先回第 12 章的排查手册找原因。带着问题的条带测出来的灰度都是空中楼阁，别浪费时间。
11.2 ImageJ 灰度分析入门
灰度分析的逻辑就是"量出每条带积攒了多少光"。用 ImageJ/Fiji 操作，大致走这几步：
打开原始未压缩图像（TIFF 最好，微信里传过一遍的 JPG 就别用了）；
用矩形工具框住第一条带，尽量贴合条带边缘，每条带用同样大小的框；
Analyze → Measure（或 Ctrl+M），记下 Integrated Density（积分密度）这一列；在每条带旁边选一块空白膜面，同样方法测出局部背景；
计算：
校正强度 = 条带积分密度 − 同尺寸背景积分密度；目标蛋白和内参分别算完再做比值：
归一化表达量 = 目标校正强度 ÷ 内参校正强度；把对照组的均值设为 1，其他组除以它，得到相对表达量；几个生物学重复各自算完，再进统计。
有个新手常掉的坑：不同软件对"黑与白"的定义可能正好相反，做之前先确认数值方向没弄反。判断方法很简单，框一条你肉眼看着很黑的条带，读数应该明显大（或者明显小，看软件约定），反常就说明方向错了。
11.3 归一化与内参选择
归一化是把上样量的微小差异从数据里扣掉的过程，内参就是那把"尺子"。常用的内参有 GAPDH（约 37 kDa）、β-actin（约 43 kDa）、α/β-tubulin（约 50 kDa）。选内参有三条硬性要求：在你的处理条件下表达稳定（缺氧、代谢类药物会动 GAPDH 的表达，这时候它就不是好尺子了）；和目标蛋白的条带位置分得开；信号不饱和。
举个实际例子吧。如果你检测的是 EEF1A2（约 50 kDa），而 α-tubulin 恰好也在 50 kDa 左右，两条带会挤在同一个位置，tubulin 就不能再当内参了，换成 GAPDH（37 kDa）或者 β-actin（43 kDa）更稳妥。检测 BIP（约 78 kDa）时就没这个烦恼，三个常规内参都够得着，挑一个表达稳定的用即可。另外，条件允许的话，用总蛋白染色（丽春红或免染体系）做归一化通常比单一内参更稳健，可以作为进阶方向。
如果做的是磷酸化蛋白，逻辑会多一层：先算 磷酸化信号 ÷ 相应总蛋白信号 得到磷酸化水平，总蛋白本身再对内参归一化。两层分开报，别想着一步到位。
11.4 图像处理的诚信红线
最后是必须划清的红线：亮度和对比度只能对整张图统一调整，绝不允许只提亮某一条带、抹掉某个杂带、把不同膜的条带拼进一张图还不标注。组会上看着或许体面，等答辩或者审稿时被翻出原始数据，那代价没人承受得起。原始图、处理参数、分析表格，全部留档，这既是科研诚信，也是保护你自己。
十二、常见失败原因与排查手册
先说排查顺序：每次只改 1–2 个变量。同时换了抗体、换了胶、又改了转膜时间，就算成功了也不知道是谁的功劳，下次换个牌子照样翻车。带着阳性对照和实验记录去排查，效率高得多。下面按"症状"组织，先找到你膜上的惨状，再顺着表格往下查。
图 12-1 九种常见失败的对照图。每一格对应下面的一个小节，先"认脸"定位症状，再顺着表格逐项排查。
12.1 完全没有条带（连内参都没有）
这种情况多半是流程里某一环整体断了。按发生概率从高到低查：
12.2 内参正常，目标蛋白没信号
12.3 整膜背景高
12.4 杂带太多
12.5 条带拖尾、竖纹
12.6 条带弯曲（微笑 / 皱眉）
经典物理原因：电泳发热。电压调低、电泳液换新的、检查外槽液位和散热，一般都能解决。微笑是两头翘中间低，皱眉正好相反，但病因和药方是一样的。
12.7 白斑、黑点与花斑
圆形白斑九成是胶和膜之间藏了气泡，下次装三明治记得在液面下操作、逐层滚压。散在黑点白点，多半是封闭液没化开、抗体聚集或者孵育盒脏了，封闭液充分溶解、必要时过滤，抗体工作液短暂离心，孵育盒刷干净。大面积花斑，就回想一下膜有没有干过、镊子有没有划过膜面。
12.8 内参饱和
内参是家养的兔子，丰度高，最容易爆表。缩短曝光、加大内参一抗二抗的稀释倍数、降低上样量都能压下去；也可以换表达量低一点的内参，或者干脆用总蛋白归一化。饱和的内参不能用来定量，这条没有商量余地。
12.9 同一样品重复性差
系统性问题优先查这几处：每次蛋白浓度有没有重新测？样品有没有反复冻融？抗体回收到第几次了？各次曝光是否都在线性范围内？灰度分析时框的大小和背景位置一致吗？把变量固定下来，重复性自然就上来了。
十三、学长的碎碎念：好习惯比天赋更重要
实验做到这里，技术层面该交代的都交代了。最后想跟你聊几件课本上不写、但真的会影响你这几年科研状态的事。
把记录本当成你的第二个大脑吧。日期、样品、抗体货号和批次、所有参数、所有异常，一次都别落下。三个月后你写论文，发现某组数据有点可疑，能翻出记录本查到当天每一个细节的人，只有你自己。还有，给每个离心管、每张膜、每个图像文件起个规范的名字，"新建文件夹(3)"这种命名是所有科研人的噩梦。
阳性对照是你的保险绳。别嫌多上一个孔浪费，等到目标条带突然消失的那天，唯一能告诉你"是抗体的问题还是样品的问题"的就是它。预实验的意识也要刻进 DNA 里：新抗体、新样品、新参数，都先用便宜的小体系试，试顺了再上珍贵样品。你那些唯一的、不可再生的病人组织，值得被认真对待。
第一次做不完美，太正常啦。合理的第一次目标是：Marker 分得开、转膜方向对、内参出带、丽春红照片正常、所有参数都有记录。做到这些就算成功，剩下的问题都是可以排查、可以进步的技术细节。
最后一条，是诚信。不修图、不选择性裁剪、不把失败的数据悄悄丢掉。科研这条路很长，名声只有一份。
那就开始把实验做完吧。
附录 A：常用缓冲液配方速查
下面是 1 L 用量的经典配方，自己配的时候可以参考；如果实验室已经有现成的稀释液，或者有自己的配方，就按说明书和实验室的惯例来。
附录 B：实验前夜检查清单
实验前夜照着勾一遍，第二天能少慌一半。
[ ] 抗体说明书已读：WB 验证、稀释比、封闭液、阳性对照
[ ] 目标蛋白分子量已查，选好胶的浓度
[ ] 泳道图已画好（含 Marker、各组、阳性对照）
[ ] 每孔上样量和各组分体积已按浓度算好
[ ] 电泳液、转膜液、TBST 已备好并正确标记
[ ] 转膜液和冷却模块已放入 4°C
[ ] PVDF 膜、滤纸、海绵、镊子、铅笔到位
[ ] 抑制剂到位，确定现用现加的时机
[ ] 成像仪时段已预约
[ ] 记录本和笔已在台边
附录 C：实验室"黑话"小抄
刚进实验室，听不懂师兄师姐在说什么？先把这几句背下来，能撑好一阵子。
参考资料
具体操作永远以你手上的产品说明书为准。下面这几份公开协议，可以用来核对通用流程：
Bio-Rad, General Protocol for Western Blotting, Bulletin 6376. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf
Cell Signaling Technology, Western Blotting Protocol. https://www.cellsignal.com/learn-and-support/protocols/protocol-western
Abcam, Western Blot Protocol: Step-by-Step Guide. https://www.abcam.com/en-us/technical-resources/protocols/western-blot
Thermo Fisher Scientific, Western Blot Protocols and Recipes. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-gel-electrophoresis-information/western-blot-protocols.html