文档性质：实验室通用操作教程（教学 / 培训用），非某一课题的正式 SOP。
内容来源：以实验室《肝癌细胞传代操作教程》（QSY，2026 年 9 月）的通用无菌操作流程为骨架，融合 ATCC / ECACC 官方细胞系资料与骨肉瘤研究文献中公开的细胞系特异性参数。
适用范围：143B、U-2 OS（人源）与 K7M2（小鼠源）三株贴壁型骨肉瘤细胞系。
重要边界：培养基配方、传代比例与消化时间随细胞系而变。实际操作请以所购细胞系的产品说明书（datasheet）与所在实验室 SOP 为最终依据。
一、背景介绍
1.1 为什么细胞必须"传代"
骨肉瘤细胞在培养瓶里贴壁生长。它们会牢牢抓住瓶底的塑料表面，靠摊平、伸展来增殖。
问题在于，瓶底面积是有限的。当细胞长到几乎铺满瓶底（这个比例叫汇合度，也叫融合度，confluence），麻烦就跟着来了：
接触抑制。细胞彼此挤压，增殖速度骤降甚至停滞；
营养与空间耗尽。培养基里的养分被大量消耗；
代谢废物累积。乳酸等产物堆积，培养基 pH 下降，细胞状态迅速恶化。
所以要定期把细胞从瓶底"取下来"，稀释后分装到新瓶里继续培养。这个动作就是传代（又称亚培养，subculture；"传代一次"即细胞分裂、传了一代）。
传代的核心目标只有一个：趁细胞状态最好（对数生长期）的时候分瓶，让它始终维持年轻、均一、可用的状态。传得太晚，细胞已经开始老化或堆叠；传得太早，又要多传几代才能长满。两头都会影响后续的实验数据。
1.2 认识你手上的细胞：143B、U-2 OS 与 K7M2
骨肉瘤（osteosarcoma）是起源于骨组织的恶性肿瘤，体外模型以贴壁生长的细胞系为主。培养之前先查清自己用的是哪一株、配套什么培养基——这一步最容易出错，也最不该省。
三个关键提醒
培养基不能互换。U-2 OS 的"原配"是 McCoy’s 5A，143B 用 EMEM（EBSS），K7M2 用 DMEM。三瓶培养基不能混用，也不能"沿用上一株的配方"。
143B 必须补 BUdR。它要额外添加 BUdR（5-溴-2′-脱氧尿苷） 才能维持 TK⁻ 表型。漏加会导致表型漂移，实验直接白做。
K7M2 是小鼠细胞。它的种属、生物安全等级与鉴定方法都和人源细胞不是一套逻辑，别把它混进人源细胞的培养基池里。
K7M2 的来路值得单独说一句。它是把小鼠骨肉瘤细胞 K7 注射进 BALB/c 小鼠胫骨，取其自发形成的肺转移灶，再植入下一只小鼠的胫骨骨旁肌肉瓣，如此反复循环后建成的细胞系。换句话说，它的"高转移"不是筛出来的，而是被体内环境一轮轮选出来的。这也是它成为骨肉瘤肺转移研究常用工具的原因。同源的 K12 株转移能力弱得多（自发肺转移率 33%，观察 140 天未见中位死亡），两者常配对使用作对照。
1.3 传代前的准备
试剂
完全培养基：基础培养基（U-2 OS 用 McCoy’s 5A，143B 用 EMEM（EBSS），K7M2 用 DMEM）+ 10% FBS（胎牛血清，提供生长因子与贴壁因子）+ 1% P/S（青霉素-链霉素双抗，抑制细菌污染）。
胰蛋白酶-EDTA 消化液：常用 0.25% 胰蛋白酶 + 0.02%–0.05% EDTA。胰蛋白酶负责切断细胞与瓶底、细胞与细胞之间的黏附蛋白；EDTA 则通过螯合钙镁离子从旁辅助解离。U-2 OS 对胰酶敏感，浓度可降到 0.05%–0.125%；K7M2 按 ATCC 协议用 0.25% 胰蛋白酶-0.53 mM EDTA。
无菌磷酸盐缓冲液（PBS 或 D-Hanks）：必须不含 Ca²⁺/Mg²⁺。血清里含有胰酶抑制剂，润洗的目的就是彻底去除残留血清；钙镁离子则会影响解离效果。
预温处理：胰酶、PBS 与完全培养基提前置于 37 ℃ 水浴预热 15–20 min，避免温差刺激细胞。
耗材与设备
培养瓶（T25 / T75）、15–50 mL 无菌离心管、无菌移液管与电动移液器、1 mL 及 200 µL 移液器与枪头
超净工作台或生物安全柜（提前 30 min 开紫外灯 / 风机消毒）、37 ℃ 恒温 CO₂ 培养箱（5% CO₂、饱和湿度）、倒置相差显微镜、台式离心机（配平衡转子）、水浴锅
75% 酒精喷壶、无菌棉签、废液缸、细胞培养记录表（或电子记录）
若 K7M2 用于体内成瘤与转移实验，还需另备 BALB/c 小鼠及相应的动物实验伦理审批
安全提示：143B 与 U-2 OS 为人源细胞系，按 BSL-2 级生物安全规范处理；K7M2 为小鼠源，ATCC 将其定为生物安全等级 1。无论等级高低，全部涉及活细胞的操作都应在生物安全柜内完成。穿实验服、戴手套与护目镜；废弃培养基、胰酶和消耗品需经含氯消毒剂处理后，按实验室生物废弃物流程处置。三株细胞建议分时段操作，移液管、培养基瓶与废液缸不要跨种属共用。
二、传代步骤：七步法
以下流程以一支 T25 培养瓶、传代至 2–3 支 T25 为例。T75 瓶的表面积约为 T25 的 3 倍，各试剂用量按比例放大 3 倍。
第 0 步：判断细胞状态与传代时机
先看显微镜，再动手。三项判定标准：
形态：细胞边界清晰、折光性好、铺展均匀，呈铺路石、梭形或成骨细胞样；
培养基：颜色仍为橙红色、澄清透明、无浑浊与漂浮颗粒。若迅速变黄或出现浑浊，提示密度过高、代谢废物累积或污染；
漂浮细胞：占比应低于 5%，细胞贴壁牢固，无大片脱落或异常空泡。
传代时机：细胞密度达到 80%–90% 最合适。
经验法则：“宁早勿晚”。 细胞密度到 80% 就可以安排传代，比等细胞过度铺满后再紧急抢救更能维持遗传与表型稳定性。连续培养不建议超过 20–30 代，重要实验务必使用低代次细胞。
步骤 1：传代前检查
所有进入超净台的东西都需75%酒精消毒！！手和袖子不可在敞开的管口或瓶子上方经过！！
提前将胰酶、PBS、完全培养基置于 37 ℃ 水浴预热 15–20 min；
打开超净台紫外照射 30 min 后关闭，开启风机，用 75% 酒精擦拭台面及双手；
从培养箱取出细胞瓶，先在倒置显微镜下确认汇合度、形态与培养基颜色，拍照记录后再操作。
步骤 2：弃旧培养基与润洗
将细胞瓶平稳移入超净台，用镊子移除封口膜，瓶口过火（酒精灯或红外灭菌器）后旋松瓶盖；
用无菌移液管吸弃全部旧培养基（T25 约 4–5 mL），移入废液缸；
沿瓶壁（避开细胞面）加入 2–3 mL 预温 PBS，轻轻晃动瓶身洗涤细胞面后吸弃。必要时重复润洗 1 次，尽量去除残留血清。
步骤 3：消化（最关键的一步）
沿瓶壁加入 0.25% 胰酶-EDTA 1–1.5 mL（T75 瓶用 3–5 mL），轻晃使消化液铺满细胞层；
盖好瓶盖，置于 37 ℃ 培养箱（或室温静置）消化。放入后第 1–2 分钟就应取出，置于显微镜下观察；
判断消化终点：细胞间隙变大、胞体回缩变圆、折光性增强，轻晃瓶身可见成片细胞滑动脱落，即可终止。通常需要 2–5 min，但不同品牌的胰酶差异较大，以镜下形态为准；
消化期间切忌拍打、剧烈摇晃培养瓶，否则细胞成团脱落，吹散时会很痛苦。
三株的消化节奏不一样。 U-2 OS 最快，143B 居中，K7M2 最慢——ATCC 给 K7M2 的窗口是 5–15 min，而且明确要求等待期间不要拍打或摇晃培养瓶。别用一个"标准分钟数"套三株细胞，各自的镜下形态才是终点信号。K7M2 一时半会儿下不来的，可以放回 37 ℃ 再等一下，不要靠晃瓶催它。
步骤 4：终止消化与收集
达到消化终点后立即加入 3–4 mL 完全培养基终止消化，血清可中和胰酶活性；
用移液管沿瓶壁轻柔吹打细胞面 5–10 次，将残余细胞完全冲下并打散，注意避免产生大量气泡；
准备无菌离心管，管盖打开正扣在台面上；
将细胞悬液转移至 15 mL 无菌离心管，取少量悬液滴于计数板或直接镜检，确认已形成分散的单细胞悬液。
步骤 5：离心
配平后于台式离心机中 800–1000 rpm（约 100–150 × g）离心 3–5 min；
取出离心管，可见管底松散的细胞沉淀。在超净台内倾去或吸弃上清，胰酶与代谢废物随上清一并除去。
可否省略离心？ 若吹打后细胞分散良好，也可以直接将含胰酶的细胞悬液稀释 5–10 倍后接种（胰酶被大量培养基稀释后活性可忽略），此法更快，对细胞的扰动也更小。但换新批次培养基、需要洗涤杂质或严格控制接种密度时，建议保留离心步骤。
步骤 6：重悬与细胞计数
向沉淀中加入 1–2 mL 新鲜完全培养基，用移液器轻柔吹打 10–15 次使细胞完全重悬，形成均匀的单细胞悬液；
取 10 µL 悬液与等体积 0.4% 台盼蓝混匀，用血细胞计数板计数并评估活力（活率应 > 90%），或使用自动细胞计数仪；
依据所需接种密度计算接种体积。
台盼蓝原理：活细胞膜完整，能排斥染料、不被染色；死细胞膜破损，被染成蓝色。所以"不被染蓝的比例"就是细胞活率。
步骤 7：分瓶、接种与标记
方式 A：按比例分瓶（维持培养常用）。将原瓶细胞悬液按 1:2 至 1:4 分装到新瓶（143B 可至 1:3–1:8，K7M2 为 1:4–1:6），每瓶补足培养基至标准工作体积（T25 为 4–5 mL，T75 为 12–15 mL）。
方式 B：按密度接种（实验前定量）。根据计数结果按目标密度接种，U-2 OS 常用工作密度为 2–4 × 10⁴ 个/cm²，使次日汇合度约 30%–50%，2–3 天后达到可实验或可传代的密度。K7M2 的密度口径低得多，ATCC 协议给的是接种 6 × 10³–8 × 10³ 活细胞/cm²、维持 5 × 10⁴–3 × 10⁵ 个/cm²，别直接照搬人源株的数字。
随后：
用十字法轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀铺展；
瓶盖旋松至通气位置（或使用透气盖），瓶身写明细胞系名、代次、日期与操作人；
将培养瓶平稳放回 37 ℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱，静置培养，24 小时内尽量不移动。
步骤 8：清理超净台
不要的细胞悬液直接倒入废液桶；
未用完的试剂需要缠好封口膜之后放入4℃冰箱保存，清理垃圾和废液桶；
用75%酒精擦拭超净台面；
拉下玻璃关闭灯光，打开紫外照射台面杀菌。
快速对照表（T25 瓶）
快速对照表（K7M2，ATCC 口径）
传代后的观察时间线
每次观察都要记录：日期、代次、汇合度、形态描述、培养基颜色、漂浮细胞比例，并留存镜下照片，逐步积累成一份完整的细胞培养日志。
三、关键注意事项
3.1 无菌操作必须贯穿始终
所有试剂开盖前过火，瓶口不接触台面；三株细胞的操作要错开时间并更换手套，种属之间尤其不要共用移液管、培养基瓶与废液缸。这是所有失败原因中最"不可原谅"的一类，也是最容易纠正的一类。
3.2 消化是变量最大的一步
不同品牌、批次的胰酶效力差异显著。建议新批次使用前先用一小瓶细胞试消化，建立自己的"时间-形态对照表"，而不是照抄别人的消化分钟数。
同时牢记"避免过度胰酶化"：一个"轻"字要贯穿消化与吹打全程。机械损伤会显著降低细胞活力，并诱导细胞产生应激反应，连带影响下游实验数据。
3.3 支原体防控
支原体（mycoplasma）污染在细胞培养中极为常见，而且不会引起培养基浑浊，肉眼与普通镜检都难以察觉。建议每 1–2 个月对培养细胞做一次支原体检测（如 MycoAlert 类试剂盒或 PCR 法）。支原体阳性的细胞应坚决废弃并重新复苏，不要试图"抢救"。
3.4 细胞鉴定与记录
这是骨肉瘤研究中风险最高、却最常被忽视的环节：
新收细胞或重要实验前做 STR 分型鉴定。STR（短串联重复序列）分型是细胞鉴定的金标准，可以理解为细胞的"DNA 指纹"。
但 STR 分型只适用于人源细胞（143B、U-2 OS）。K7M2 是小鼠细胞，没有同等规模的公开比对库，种属确认要靠物种特异性 PCR、线粒体 COI 条形码，或向供应商索取小鼠 STR 图谱。
反过来说，如果某株"人源"细胞的人类 STR 分型怎么都对不上，先别急着怀疑操作污染，做一次种属鉴定——有可能它根本不是人的。
全局数据相当刺眼：国际细胞系鉴定委员会（ICLAC）已列出 530 余株错误识别细胞系；有统计显示，超过 32,500 篇论文引用了被 ICLAC 判定为错误识别的细胞系；常见细胞系中高达 33% 存在同种或异种细胞、支原体或病毒污染。
骨肉瘤领域甚至有真实案例：某研究宣称建立的新细胞系 ZOSL-1，经 Cellosaurus 的 CLASTR 工具比对 7,600 余株人源细胞系后，被证实实为已有 HOS 系（或其衍生系 MNNG/HOS）。143B 本身就是 HOS 的衍生株，这类亲缘关系一旦记录不全，极易认错。
坚持记录代次（建议同时记录 population doubling，群体倍增数），并将传代次数纳入实验报告。这条对 K7M2 尤其重要：体内接种用的是同一批细胞，代次与活率会直接写进成瘤率和转移率里。
3.5 CO₂ 培养箱管理
定期校准 CO₂ 浓度与温度；水盘使用无菌水并每周更换，防止霉菌滋生。培养箱往往是污染的共同源头，管理一松散，全实验室的细胞一起遭殃。
3.6 三株细胞各自的坑
培养基别搞混。 U-2 OS 用 McCoy’s 5A，143B 用 EMEM（EBSS）另加 BUdR，K7M2 用 DMEM。三瓶培养基同时摆在超净台上，就是最容易出事的时候——最稳妥的做法是一次只开一瓶。
143B 的 BUdR 不能漏。 这是维持其 TK⁻ 表型的必要条件，漏一次就可能出现表型漂移。
U-2 OS 别消化过头。 它贴壁牢固但对胰酶敏感：消化不足难以吹散，消化过度则大量成团并出现死细胞。必须在镜下实时监控，一旦变圆立即终止。
K7M2 别催。 ATCC 给它的消化窗口是 5–15 min，比两株人源细胞长得多，等待期间也不能拍打、摇晃培养瓶——它比人源株更容易成团。按 143B 的节奏去卡它，结果往往是嫌它下不来、再加一次胰酶，最后细胞没事也会被你折腾出应力反应。
3.7 常见问题排查表
四、结语
传代看起来只是"倒液、加酶、分瓶"三步动作，真正决定实验成败的却是三件事：
在正确的时机动手。汇合度 80%–90%、处于对数生长期，宁早勿晚；
把变量控制住。尤其是消化时间与接种密度，靠自己的记录表，而不是他人的经验值；
守住身份与代次两条底线。STR 鉴定加代次记录，避免用错误的细胞做出漂亮却无效的数据。
对这三株细胞而言，还需额外记住：培养基是三套配方，143B 要补 BUdR，U-2 OS 对胰酶敏感，K7M2 消化要慢、而且它是小鼠细胞。
免责声明：本教程为通用操作培训材料，具体细胞系的培养基配方、消化液浓度、传代比例与代次限制，请始终以供应商产品说明书及实验室 SOP 为准。
参考资料
实验室《肝癌细胞传代操作教程》，QSY，2026 年 9 月（本文流程骨架来源）。
ECACC / Culture Collections — U-2 OS 细胞系档案（Cat. 92022711）：培养基 McCoy’s 5a + 1.5 mM 谷氨酰胺 + 10% FBS，70–80% 汇合传代，接种 2–4 × 10⁴ 个/cm²。 https://www.culturecollections.org.uk/products/celllines/detail.jsp?refId=92022711
ECACC / Culture Collections — 143B 细胞系档案（Cat. 91112502）：EMEM(EBSS) + 2 mM 谷氨酰胺 + 15 µg/mL BUdR + 1% NEAA + 10% FBS。 https://www.culturecollections.org.uk/nop/product/143b
ATCC — K7M2 wt [K7M2-WT]（CRL-2836）产品档案：小鼠 BALB/c，成骨细胞，DMEM + 10% FBS，传代比例 1:4–1:6，倍增时间约 31 h，接种 6–8 × 10³ 活细胞/cm²，生物安全等级 1，接种后 >90% 自发肺转移。 https://www.atcc.org/products/crl-2836
Khanna C, et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clin Exp Metastasis 2000;18:261-271（K7M2 与 K12 肺转移能力对照）。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11315100/
Khanna C, et al. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med 2004;10:182-186. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14704791/
ENCODE Project — U-2 OS 细胞培养协议（Farnham Lab）：85% 汇合传代，1:4 分瓶，每 4–5 天一次。 https://www.genome.ucsc.edu/ENCODE/protocols/cell/human/U2OS_Farnham_protocol.pdf
Identification of tumorigenicity-associated genes in osteosarcoma cell lines. J Cancer — 骨肉瘤细胞系培养条件与致瘤性相关基因分析，含 143B 培养条件对照。 https://www.doi.org/10.7150/jca.37393
Crown Bioscience — Authenticating Your Cell Lines: Why, When and How：ICLAC 已列 530+ 错误识别细胞系，>32,500 篇论文受影响，常见细胞系污染率高达 33%。 https://blog.crownbio.com/authenticating-your-cell-lines
Cellosaurus STR Similarity Search (CLASTR)：https://www.cellosaurus.org/str-search/